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浅议鲎试验法中不容忽视的几个问题
作者:褚衍立,张淑英,张淑梅   2019.06.11   点击49次

目前,细菌内毒素检查法(鲎试验法),应用于临床药物检验日益广泛。为确保检验的准确性,现简述几个不容忽视的问题。

1、鲎试剂灵敏度复核问题

中国药典1995版已明确规定,在鲎试验前需进行鲎试剂灵敏度复核,计算标准差S应小于0.365,鲎试剂灵敏度λ:0.5λb≤λ≤ 2λb(λb为厂家标示值)。据笔者所见,使用鲎试剂检查内毒素的单位均不进行复核试验。而不同厂家生产的鲎试剂质量不尽相同。据笔者复核几家鲎试剂显示,试验为阳性的检品家兔法复核并无热原反应。厦门鲎试剂厂的鲎试剂质量较好,复核试验的灵敏度与标示灵敏度基本一致。以上情况应引起用户注意,否则会影响结果的准确性。

2、干扰试验

干扰试验是评价样品浓度对鲎试剂及内毒素凝集反应的干扰程度与性质,以便初步筛选出对检查无干扰样品的浓度范围。若干扰试验存在干扰,应注意最大有效稀释MVD与最小有效浓度MVC的计算,

其计算方法如下:

MVC=λ· m/k式中λ为鲎试剂灵敏度,m为兔或人的最大剂量/kg,K为规定给药途径,临床无任何不良反应的内毒素阈值静脉为5.0 Eu·kg-1(包括皮内、皮下、腔内)。鞘内为0.2 Eu·kg-1。

MVD=样品浓度/MVC或MVD=L/λ式中L为样品内毒素限值)。若鲎试剂的灵敏度λ= 0.25 Eu·ml-1,人的最大剂量为30 mg·kg-1或2 ml·kg-1(样品浓度为15 mg·ml-1)则:MVC=0.25 Eu·ml-1× 30 mg·kg - 15.0Eu·Kg-1= 1.5mg·ml-1MVD=15mg·ml - 11.5mg·ml-1= 10倍或:MVD=Lλ=km·λ=5Eu·Kg - 12ml·Kg - 1× 0.25Eu·ml-1= 10倍  

在进行干扰试验时,如样品以基准稀释倍MVD为起点,等倍往下稀释,应根据出现阳性反应的稀释倍数求出适合这种稀释倍数的鲎试剂灵敏度。如某样品的基准稀释倍数为5倍、L值= 2.5 Eu·ml-1;于5倍、10倍稀释并未出阳性,而稀释20倍时干扰试验阳性,那么适合做20倍稀释的干扰试验的鲎试剂灵敏度:λb=LMVD20=2.5Eu·ml - 120= 0.125Eu·ml-1即这种样品应以灵敏度为0.125Eu·ml的鲎试剂进行干扰试验。

3、PH值问题

鲎试验最适宜pH值为6.4~8.0,pH值过大过小都影响鲎试剂灵敏度及内毒素活性。最简单解决pH值干扰的方法是稀释减少干扰;在样品中加入预先确定量的酸碱中和再稀释或采用具有缓冲作用的鲎试剂。

4、鲎试验中细菌内毒素的振荡问题

中国药典1995年版规定:内毒素复溶后应置旋涡混合器振荡15 min,以后每稀释一步需混合振荡0.5 min。但是目前多数试验单位没有旋涡混合器,只轻轻振摇或不振摇直接进行试验。某厂家报道,若采用旋涡混合振荡法稀释内毒素、效价测定结果与国际参考标准内毒素(IS)基本一致,若不经振荡稀释则内毒素效价比国际参考标准内毒素低(50~75)%。原因是,内毒素是亲水与疏水双重活性的两性分子,脂性端LipidA端是脂多糖(LPS)的主要毒性部位,在实验中与鲎试剂反应。复溶后如果不剧烈振荡,Lipid A端由于疏水内毒素易形成泡状囊,Lipid A位于囊的中心,而不能与鲎试剂充分接触,影响阳性对照结果,误以为实验失败。

5、药物中细菌内毒素限值L

L值是指单位药物中所含内毒素的最大允许量,药品所含内毒素低于这个限值时,按指定途径给药是安全的。内毒素限量L= k·m-1式中k为内毒素阈值,m为药品家兔注射剂量以ml·kg-1,mg·kg-1,u·kg-1等表示。

6、鲎试验的环境问题

1995年版药典只规定在实验中防止微生物污染,而没有作详细环境规定。试验者往往在未经净化处理的环境中试验,造成实验失败。笔者几年的经验证明。鲎试验在净化工作台内进行,并进行严格的操作者消毒与隔离,效果是满意的。

7、鲎试验器具的选择与处理

试验器具对试验结果有直接影响,采用一次性针管不符合规定,采用聚丙烯试管也不恰当。笔者认为,采用玻璃试管及金属针头,清洁液浸泡玻璃试管,洗涤剂浸泡金属针头。蒸馏水冲洗至pH呈中性,于250℃干烤30 min,实验无失败现象。

8、实验鲎试剂灵敏度选择

为了保证内毒素检查与家兔试验结果相一致,鲎试剂灵敏度应不超过0.5Eu·ml-1。

本文来自:山东省巨野县人民医院
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